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　　非洲豬瘟病毒熒光等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒Neeg Asmeskas swine fever kab mob fluorescence isothermal amplification nrhiav kom tau cov khoom siv【FT-ZWSJ2】督促嚴(yán)格落實(shí)產(chǎn)地檢疫、屠宰環(huán)節(jié)*獸醫(yī)派駐和非洲豬瘟自檢的相關(guān)制度，加大調(diào)運(yùn)環(huán)節(jié)、無害化處理等環(huán)節(jié)的監(jiān)管力度，強(qiáng)化閉環(huán)管理，阻斷疫情的傳播渠道。

　　非洲豬瘟病毒熒光PCR核酸檢測(cè)試劑盒說明書

　　【獸藥名稱】

　　通用名稱：非洲豬瘟病毒熒光PCR核酸檢測(cè)試劑盒

　　漢語拼音:Feizliouzhuwen Bingdu Yingguang PCR Hesuan Jianceshijihe

　　英文名稱：African swine Fever Virus (ASFV) PCR Nucleic Acid Diagnostic Kit

　　商品名稱：無

　　【主要成分與含量】試劑盒中含有如下組分:

　　【用法與判定】

　　1 用法

　　1.1待檢樣品釆集、保存及運(yùn)輸

　　1.1.1樣品釆集

　　(1) 活豬樣品 無菌采集抗凝血或血清5mL

　　(2) 病死豬剖檢樣品或屠宰場(chǎng)剖檢樣品 無菌采集死豬的牌、肺、腎、扁桃體、淋巴結(jié)、肌肉等組織樣品。2?8°C低溫運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室用于檢測(cè)。

　　(3) 病豬污染的周邊環(huán)境 采集與病豬相關(guān)場(chǎng)所的糞便、飼料、污水樣品。2?8°C低溫運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室用于檢測(cè)。

　　1.1.2樣品保存 采集的樣品在2?8°C保存應(yīng)不超過24小時(shí)，-70°C條件下保存，避免反復(fù)凍 融。

　　1.1.3樣品運(yùn)輸泡沫箱加冰袋后密封進(jìn)行運(yùn)輸。包裝和運(yùn)輸應(yīng)符合農(nóng)業(yè)農(nóng)村部《高致病性動(dòng)  物病原微生物菌(毒)種或者樣品運(yùn)輸包裝規(guī)范》和交通運(yùn)輸部門關(guān)于危險(xiǎn)品運(yùn)輸管理的有關(guān)規(guī)定。

　　1.2樣品處理

　　1.2.1血液樣品處理 抗凝血樣品置于離心管中，8000 r/min離心2分鐘取上層血漿，編號(hào)待 檢。非抗凝血樣品置于離心管中，待凝固后，8000  r/min離心2分鐘取200μL上層血清，編號(hào)待檢。

　　1.2.2組織樣品處理取適量脾臟、肝臟、淋巴結(jié)、扁桃體、肌肉等組織，置于研磨器或研磨管中研磨，再加適量生理鹽水混勻，制成約10%的組織勻漿，8000  r/min離心2分鐘，取200μL上 清于RNase/DNase-free無菌離心管中，編號(hào)備用。

　　1.2.3環(huán)境樣品處理

　　1.2.3.1糞便、飼料樣品處理方法取適量的糞便、飼料放入盛有PBS緩沖液的研磨管中研磨混勻，制成約10%的勻漿液.8000  r/min離心2分鐘，取200μL上清于RNase/DNase-free無菌離心 管中，編號(hào)備用。

　　1.2.3.2污水樣品處理方法 直接取200μL污水進(jìn)行核酸提取。

　　1.3病毒核酸的提取用磁珠法或柱式法進(jìn)行DNA核酸提取。

　　1.4熒光PCR反應(yīng)：

　　1.4.1從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液、酶混合液，室溫融化后，2000 r/min離心5秒。設(shè)被  檢樣品、陽性對(duì)照和陰性對(duì)照總和為n,則反應(yīng)體系配制如下：

　　試劑 體系

　　PCR 反應(yīng)液 17× (n+1) μL

　　酶混合液 3× (n+1) μL

　　1.4.2在新的RNase/DNase-fire 1.5 ml離心管中加入上述試劑，充分混勻后瞬時(shí)離心。按照20μL/  管分裝量將試劑分裝至熒光PCR反應(yīng)管。

　　1.4.3在上述制備好的熒光PCR反應(yīng)管中分別加入陰性對(duì)照、陽性對(duì)照各5μL、處理好的待測(cè)核酸各5μL,終體積25μL/管，蓋好熒光PCR反應(yīng)管蓋，混勻后瞬時(shí)離心，轉(zhuǎn)移到熒光PCR儀器  上。

　　144將PCR反應(yīng)管放置在熒光PCR儀樣品槽中，在熒光PCR儀上運(yùn)行以下程序：

　　熒光通道選擇FAM,在PCR擴(kuò)增階段每個(gè)循環(huán)的55℃時(shí)采集熒光信號(hào)。設(shè)置擴(kuò)增體系為25μL, 同時(shí)要選擇passive  reference和quencher為none的模式。(注：若熒光PCR儀(如AB17500)按說明  書中的反應(yīng)程序設(shè)置后因持溫時(shí)間短無法運(yùn)行，可將預(yù)擴(kuò)增和PCR擴(kuò)增條件變更為95C： 5秒 55°C： 30 秒)

　　2結(jié)果判定

　　2.1試驗(yàn)有效性判定

　　陽性對(duì)照有典型擴(kuò)增曲線且Ct值≤30.且陰性對(duì)照無Cl值或無擴(kuò)增曲線，線形為直線或輕微斜線，無指數(shù)增長(zhǎng)期。則判試驗(yàn)結(jié)果有效。否則，此次試驗(yàn)視為無效。

　　2.2樣品判定

　　2.2.1陽性：樣本檢測(cè)結(jié)果Ct值≤35且有明顯指數(shù)增長(zhǎng)期，判定檢出非洲豬瘟病毒核酸。

　　2.2.2可疑：樣本檢測(cè)結(jié)果Ct值在35?38范圍內(nèi)。此時(shí)應(yīng)對(duì)樣本進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)，如果重復(fù)實(shí)驗(yàn)  結(jié)果Ct值仍在35?38范圍內(nèi)，有明顯指數(shù)增長(zhǎng)期.則判定為陽性，否則為陰性。

　　2.2.3陰性：樣本檢測(cè)結(jié)果Ct值>38或無Ct值，判定未檢出非洲豬瘟病毒核酸。

　　【注意事項(xiàng)】(1)實(shí)驗(yàn)前請(qǐng)仔細(xì)閱讀本試劑盒說明書，嚴(yán)格按照操作步驟執(zhí)行，在操作過 程中對(duì)時(shí)間、試劑體積等精確控制可以獲得結(jié)果。

　　(2) 實(shí)驗(yàn)室應(yīng)嚴(yán)格按照有關(guān)規(guī)定分區(qū)管理，依照配液區(qū)-模板提取區(qū)-擴(kuò)增區(qū)-分析區(qū)順序  進(jìn)行基因檢測(cè)。各區(qū)間人員、器材、試劑及空氣流向應(yīng)有嚴(yán)格要求。

　　(3) 核酸提取有關(guān)耗村確保潔凈、無DNase/RNase,提取過程盡量低溫、快速，完成后進(jìn)入 下一步實(shí)驗(yàn)或凍保。

　　(4) 對(duì)于頂部采光儀器要帶新的一次性PE手套對(duì)熒光PCR管封蓋，對(duì)于底部采光儀

　　器要避免徒手或使用過的手套接觸熒光PCR管底，檢測(cè)過程中使用不帶熒光物質(zhì)一次性乳膠手套。

　　(5) 凍存試劑使用前應(yīng)于室溫下*融化，瞬時(shí)離心使液體*沉于管底。避免反復(fù)凍融， 以免影響試劑性能。

　　(6) 樣品、陽性對(duì)照等在使用后及時(shí)封蓋，.避免組分間及氣溶膠等的污染造成假陽性。

　　(7) 擴(kuò)增產(chǎn)物禁止開蓋，實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的廢棄物應(yīng)及時(shí)收集，遠(yuǎn)離PCR實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行無害化處理。

　　【規(guī)格】50頭份/盒